尿激酶变体Glu154-mtcu-PA的构建及其性质研究

【摘要】 利用寡核苷酸介导的定点突变方法，将重组人尿激酶原（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，简称ｒｓｃｕ－ＰＡ）中Ａｒｇ１５４突变为Ｇｌｕ１５４，得到尿激酶原变体基因（以下称作ｍｓｃｕ－ＰＡ）。该尿激酶原变体和未突变的重组尿激酶原（ｒｓｕｃ－ＰＡ）均在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。经体外变复性，Ｚｎ２＋选择性沉淀以及抗体亲和柱层析，两种表达产物均被纯化。纯化后的尿激酶原变体和未突变的重组尿激酶原对纤溶酶的敏感性表现一致。两种产物经纤溶酶活化后，分别得到了双链尿激酶（ｒｔｃｕ－ＰＡ）和双链尿激酶变体（以下称作ｍｔｃｕ－ＰＡ），它们对人工合成的发色底物Ｓ２４４４反应的米氏动力学常数Ｋｍ分别为８０μｍｏｌ／Ｌ和８７μｍｏｌ／Ｌ，表明突变没有影响双链尿激酶变体的酶活性中心；而对血纤维蛋白的溶解和对血浆中纤维蛋白原的降解实验显示，该双链尿激酶变体对血纤维蛋白的选择性优于未突变双链尿激酶，甚至还优于未突变的尿激酶原。更多还原