【作者】 刘旭冬；

【导师】 于灵芝；

【作者基本信息】 山东大学 ， 临床医学（麻醉学）（专业学位）， 2018， 博士

【摘要】 背景目前全世界面临着社会老龄化,而骨质疏松症致骨折这一健康问题受到越来越多的关注。骨质疏松症是全身性的骨骼疾病,骨强度降低是其特点,这将急剧增加病人骨折的风险性。目前主要以药物治疗为主,只能改善和延缓发展病情,并不能达到治疗甚至是逆转的效果。对骨质疏松症深入研究发现,其发病主要原因之一是产生炎症因子。研究发现,包括在绝经后、继发性、糖尿病性骨质疏松中,IL-17表达有显著变化。IL-17细胞因子家族包含IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17F六个成员,包含153-202个氨基酸,相对分子量在20000-30000之间。其中,由TH17等免疫细胞分泌的炎症因子IL-17F,可诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)定向迁移并向成骨细胞(osteoblast,OB)分化。L-17家族成员通过与特定细胞表面受体相互作用激活下游信号传导,其受体家族包含 IL-17RA、IL17RB、IL-17RC、IL-17RD 和 IL-17RE 五个成员。IL-17R可以激活许多下游信号通路。其中研究较为广泛的是IL-17RC和IL-17RA,部分原因是它们够特异性的与IL-17A和IL-17F结合相互作用后形成受体复合物。虽然IL-17RA和IL-17RC可以共同调节IL-17信号通路,IL-17RC和IL-17RA分别有诸多不相同的功能。在自身免疫性疾病中(骨质疏松症也被认为是一种免疫性疾病),IL-17RC和IL-17RA参与了发病机制。IL-17RC和IL-17RA在有效防治骨质疏松症这一领域,将成为新的研究热点。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)是一组具有高度相似结构的多功能分泌性蛋白。在成骨细胞分化过程中,在BMPs家族中BMP-2通过先形成软骨再形成骨促进骨生成。而且,BMP-2还可以作为破骨细胞分化因子参与骨骼重建。各种成骨细胞中BMP-2的表达也可以被某些药物或者细胞因子促进表达从而影响骨形成。在骨骼系统生长发育中,调节因子Noggin对骨的作用逐渐为人们熟知。Noggin广泛表达在机体内的多种组织中,尤其是在神经和骨骼系统中,并与BMP相互作用共同完成多项调节机制。目的至今为止,IL-17F及IL-17R对骨质疏松症作用机制尚不明确,且在分子水平上对Noggin和BMPs相互关系以及调节骨代谢的作用也还需进一步研究。因此,本论文基于课题组前期对骨质疏松大鼠的成骨细胞代谢的研究,进一步探讨IL-17F对大鼠成骨细胞增殖影响,以及其受体IL-17RA和IL-17RC、成骨细胞因子骨形态蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2,BMP-2)和抑制因子Noggin表达的变化。方法1.大鼠原代成骨细胞提取与培养本实验选用胰酶-胶原酶消化法取得原代成骨细胞。取6只Wistar大鼠乳鼠(出生24h内),脱颈、处死,无菌操作台取出颅盖骨后,剔除其表面的骨膜及结缔组织,用PBS缓冲液反复冲洗骨片至透白发亮,将颅盖骨用眼科剪将骨片剪碎。向骨片中加入0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃恒温水浴中消化,并不停的震荡。消化后,用移液管吸弃胰酶。之后加入1%11型胶原酶,放入37 ℃恒温水浴中二次消化。离心后白色沉淀是成骨细胞,加入培养基后放入培养箱,待原代长满后即可以进行传代。当原代成骨细胞状态良好,且融合度达到可传代时,采用差速贴壁法去除贴壁的纤维细胞。细胞纯化后,最后选取第四代细胞用于实验。在倒置显微镜下观察成骨细胞的细胞形态,并拍照。2、实验分组及IL-17F刺激取纯化后的第4代成骨细胞,细胞计数后调整细胞浓度为4×105/ml,以每孔100 μl接种到96孔板中,对照组使用正常含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液进行培养,实验组:用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配制的含有不同浓度(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)IL-17F 的培养液进行培养,分为1 ng/ml组、10 ng/ml组、20ng/ml组、50 ng/ml组和100 ng/ml组5个实验组。在无血清且低糖DMEM培养基中,成骨细胞培养24 h后加IL-17F进行刺激。5 个实验组中,加入浓度为 1 ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml 和 100ng/ml IL-17F的低糖且含有10%牛胚胎血清DMEM培养液,测定第1、3、5天后的细胞增殖活性。3.指标检测采用 MTT 检测方法,测定 IL-17F 浓度为 1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml干预后的第一天、第三天和第五天时,利用酶标仪在570 nm波长下测定的吸光度值,确定成骨细胞增殖情况。采用实时荧光定量Real time-PCR方法,检测IL-17F浓度为1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml干预后第一天、第三天和第五天时,成骨细胞中IL-17RA,IL-17RC,BMP-2及NogginmRNA的表达水平情况。采用免疫蛋白印记方法(Western Blot),检测成骨细胞内IL-17F浓度为1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml 干预后的第五天时 IL-17RA、BMP-2和noggin蛋白表达水平变化。·结果1.大鼠原代成骨细胞鉴定:无菌条件下培养三天后,观察发现细胞生长贴壁稳定,细胞形态和生长状况均符合特征,细胞成簇生长,形状呈不规则多边形。显微镜下观察到,成骨细胞核明显且轮廓清晰。到第5-7天,原代细胞的融合度超过75%,可以进行下一步传代。差速贴壁法对细胞纯化,第四代细胞进行进一步实验。钙钴法碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色结果示,成骨细胞的胞膜、胞质中,均见ALP染色成深染块状沉淀。2.IL-17F对成骨细胞增殖的影响MTT结果显示,在相同时间条件下,与对照组相比,成骨细胞的增值率呈现溶度依赖性;在相同IL-17F干预浓度下,成骨细胞的增值率随时间增长有一定的升高;20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml实验组的OD值在第一天、第三与第五天均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);浓度为100 ng/m的IL-17F1干预后第五天,成骨细胞的增殖率最高。3.IL-17F对成骨细胞IL-17RA及IL-17RC mRNA表达的影响RT-PCR结果显示,从第一天开始,当IL-17F的浓度大于20 ng/ml时,实验组IL-17RA mRNA水平均显著上调(P<0.05),且表现为浓度依赖。而且,当IL-17F的浓度达到100 ng/ml时,无论是在第一天、第三天还是第五天,IL-17RA mRNA表达量相较于当天的50ng/ml时有了显著性提高(P<0.05)。然而,在IL-17F相同浓度下,IL-17RA mRNA的表达却没有呈现时间依赖性,在第三天升高后却在第五天有所降低。第三天时,在IL-17F浓度为100 ng/ml,IL-17RA mRNA表达量峰值出现。与IL-17F刺激对IL-17RA mRNA影响较大不同的是,只有在最高浓度刺激下(100 ng/ml),IL-17RC的mRNA才显著提高(P<0.05)。而且,在IL-17F浓度为100ng/ml时,也出现了 IL-17RC的mRNA表达先升高再降低的情况,第三天表达水平最高,第五天微小回落。4.IL-17F对成骨细胞BMP-2及Noggin mRNA表达的影响与对照组相比,当 IL-17F 在 20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml 浓度下,BMP-2 mRNA表达水平从第一天开始明显升高(P<0.05)。在同一时间内,BMP-2 mRNA水平随着IL-17F浓度的升高也上调,但未表现出时间依赖性。在相同IL-17F浓度下,BMP-2 mRNA表达量在第三天达到最高水平,却在第五天有所降低,呈现出先升高后降低的趋势。此外,在第三天和第五天IL-17F浓度为100 ng/ml时,与相同时间下刺激浓度为50 ng/ml实验组相比,BMP-2 mRNA表达量有显著性升高(P<0.05)。作为BMP-2内源性拮抗剂,noggin mRNA表达水平变化趋势与BMP-2 mRNA正好相反。IL-17F干预浓度为20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml时,从第一天开始,实验组Noggin mRNA水平明显下调(P<0.05),并表现出浓度依赖性。在相同IL-17F浓度下,Noggin mRNA的表达先降低升高,并在第三天IL-17F为最高刺激浓度时BMP-2抑制效果最明显(P<0.05)。此外,IL-17F浓度为100 ng/ml时,与相同时间条件下,与刺激浓度为50 ng/ml实验组相比,Noggin mRNA表达量有显著性降低(P<0.05)。5.IL-17F对成骨细胞IL-17RA、BMP2、noggin蛋白表达的影响IL-17F干预第五天,与空白组相比,20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml浓度下BMP-2 与 IL-17RA 蛋白表达水平显著提高(P<0.05),而 20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml实验组Noggin蛋白表达水平变化趋势与IL-17RA和BMP-2相反(P<0.05)。结合RT-PCR结果,当浓度为100 ng/ml时,IL-17F可以同时刺激IL-17RA和IL-17RC受体发挥作用(P<0.05)。结论浓度为20ng/ml、50ng/ml、100ng/mL的IL-17F,可以刺激体外大鼠成骨细胞增殖,并在大鼠成骨细胞中,BMP-2mRNA与蛋白表达明显提高,同时降低Noggin mRNA和蛋白表达,部分呈剂量-时间依赖性,考虑到20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml 的IL-17F 显著促进 IL-17RA 蛋白和 mRNA 表达,但 100 ng/ml的IL-17F能同时提高IL-17RA和IL-17RC蛋白和mRNA表达。综上所述,我们认为IL-17F促进成骨细胞增殖增殖、存活和功能影响的作用机制可能是通过影响Noggin、BMP-2蛋白和mRNA的表达来实现的,而且受体是IL-17RA和IL-17RC。更多还原

【Abstract】 ObjectiveWith the aging society becoming more and more serious,the fracture caused by osteoporosis has become a health concern all over the world.Mounting studies of osteoporosis has demonstrated that one of the major causes is over production of inflammatory factors.Inflammatory cytokines IL-17A and IL-17F,secreted by TH17 cells,can stimulate bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)to migrate and differentiate into osteoblasts(OB).So far,the underlying mechanism of the effect of IL-17F on osteoporosis is unclear.Based on the preliminary study on osteoblast metabolism in osteoporosis rats,we researched the effects of IL-17F on the proliferation of osteoblasts,and measured the levels of protein and mRNA expressions of IL-17F receptor(IL-17RA and IL-17RC),Bone Morphogenetic Protein 2(BMP-2)and its inhibitor Noggin.Methods1.Rat primary osteoblasts cell isolation,culture and identificationUnder the aseptic conditions,six new-born(younger than 24 h)Wistar rats were sacrificed and took skulls.After repeated washing,the osteocommas were cut into pieces.Primary osteoblasts were isolated by trypsin,cultured with low glucose DMEM medium containing 10%fetal bovine serum and purified by differential adhesion of subculture.We selected the fourth purified generation osteoblasts for further experiment.2.Experimental grouping and stimulation of IL-17FThe cells were divided into the control group and different IL-17F stimulating groups.The control group used normal medium and the experiment group used medium added with 1,10,20,50,100 ng/ml IL-17F respectively.3.Detecting indexesProliferation activity of osteoblasts were tested by MTT assay.The mRNA transcriptions of IL-17RA,IL-17RC,BMP-2 and Noggin were investigated with real time fluorescent quantitative,and protein expressions of IL-17RC,BMP-2 and Noggin were also detected by western blotting.Results1.Rat primary osteoblasts cell isolation,culture and identificationThe characters and growth status of adherent osteoblasts accorded with the feature of osteoblasts,and they were stable during culture.The results of ALP staining demonstrated that the positive cells,which were osteoblasts,were full of black dyeing precipitation.2.Effect of IL-17F on proliferation activity of osteoblastsThe MTT results showed that the rate of osteoblasts proliferation was dose-dependent and time-dependent to some degree stimulated by the same concentration of IL-17F.In the first,third and fifth days,the OD value of 20,50 and 100 ng/mL were significantly higher than control group(P<0.05).And at the concentration of 100ng/mL on the fifth day,IL-17F had the greatest influence on the proliferation of osteoblasts.3.Effect of IL-17F on IL-17RA and IL-17RC mRNA expressionsOn the first,third and fifth day,the mRNA transcription of IL-17RA at 20,50 and 100 ng/mL were significantly increased with dose-dependent(P<0.05).However.only at the concentration of 100 ng/mL of IL-17F,the expression of IL-17RC was markedly raised(P<0.05).4.Effect of IL-17F on BMP-2 and Noggin mRNA expressionsCompared with the control group,at the dose of 20,50 and 100 ng/mL of IL-17F,the levels of BMP-2 mRNA expression began to rise from the first day(P<0.05)with a dose-dependent manner.However,the expression levels of Noggin mRNA were significantly decreased from the first day stimulated by 20,50 and 100 ng/mL of IL-17F in a dose dependent manner.5.Effect of IL-17F on IL-17RA,BMP-2 and Noggin protein expressionsCompared with the control group,at the dose of 20,50 and 100 ng/mL of IL-17F,the levels of BMP-2 and IL-17RA expressions significantly raised(P<0.05)with a dose-dependent manner.However,the expression level of Noggin significantly decreased stimulated by 20,50 and 100 ng/mL of IL-17F in a dose dependent manner.(P<0.05).ConclusionThe dose of 20,50 and 100 ng/mL of IL-17 can stimulate osteoblasts proliferation of rat in vitro,improve the BMP-2 mRNA and protein expressions,and decrease Noggin mRNA and protein expressions in dose-dependent and time-dependent manners.Therefore,we proposed that IL-17F at the low dosage promoted the proliferation of osteoblast mainly via IL-17RA but IL-17RC,while IL-17F at the high dosage promoted the proliferation of osteoblast by both IL-17RA and IL-17RC.更多还原