【作者】 陈洁；

【导师】 茅彩萍；

【作者基本信息】 苏州大学 ， 妇产科学， 2017， 博士

【摘要】 妊娠期高血压疾病（妊高症）指的是孕妇在怀孕前血压较为正常,在妊娠2O周后开始出现高血压、蛋白尿,国内的发病率为5%¹0%,子痫前期是属于妊高症的一种,重度子痫前期可能会影响孕妇的各器官系统,在妊娠中子痫前期的发病率是4%⁷%,是一种严重危害母婴健康的妊娠并发症,也是我国孕产妇死亡的四大原因之一。尤其是孕32周前发生的子痫前期由于发病早、距离足月为时远、母体病情发展快、并发症重,新生儿孕周小、出生后并发症多及存活率低等等,已成为产科领域的研究的重点。现在子痫前期发病机制不明,包括滋养细胞侵袭异常、过度氧化应激、炎症细胞过度激活、内皮功能受损等等。子痫前期的基本病理体征就是全身小血管的痉挛,而血管内皮细胞对维持血管张力是至关重要,所以目前,血管内皮系统功能损伤被认为是妊高症发生的主要因素之一,然而,有关血管内皮系统性损伤导致妊高症发生的病理机制并不明确。有研究认为内皮细胞受损导致其分泌功能的异常是高血压发生的重要病因之一。一氧化氮是（NO）是衡量血管内皮功能的重要因子,它的合成分泌离不开它的限速酶一氧化氮合成酶（NOS）.实验证实了子痫前期患者胎盘组织内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）含量明显降低。而且前面提到过多氧化应激也是引起子痫前期的病因之一。同时发现自由基与内皮细胞损伤有密切联系。所以氧化应激和NO合成酶在妊高症的内皮细胞功能方面发挥重要的作用,两者之间是不是有关联尚不明确。理论证明Ca²⁺依赖型K⁺通道（KCa通道）参与到内皮细胞的合成和分泌,参与到了血压调节。研究发现了KCa通道之一的SKCa通道同样调节了子宫平滑肌细胞的活性,继而调节了子宫血管的收缩舒张,而且SKCa通道的抑制剂使用使得血压升高。SKCa通道对血压的调节至关重要。所以可以推测,内皮细胞功能的改变和KCa通道、氧化应激有一定的联系。本研究的目的就是为了找出三者之间的联系,由此研究内皮细胞受损的机制,在子痫前期的病发前及时作出预测和进行有效的治疗和预防,对有效防控子痫前期的发展具有重大的意义。本研究选取子痫前期患者（Preeclampsia,PE）和正常孕妇（Normal pregnancy,NP）为两组研究对象,收集研究对象的脐静脉内皮细胞,通过检测子痫前期的脐静脉内皮细胞功能,来进一步验证子痫前期患者的内皮细胞功能的损害是该病重要的发生机制;通过检测子痫前期的脐静脉内皮细胞的钾离子通道电流,来研究离子通道在子痫前期患者内皮细胞受损中的作用,并进一步通过检测子痫前期的氧化应激的合成物—超氧化物的含量和蛋白基因表达,来研究氧化应激与细胞钾通道功能间的关联及其在子痫前期患者内皮功能中的作用。研究结果表明,子痫前期的脐静脉内皮细胞的NO含量和eNOS的表达均明显降低;子痫前期的病理状态,导致超氧化物的含量增高,过度的氧化应激会产生过多的氧自由基,NOX是氧自由基（ROS）的主要酶体,检测子痫前期脐静脉内皮细胞的NOX2的基因和蛋白表达以及培养液的NOX2的含量明显增加;子痫前期的细胞钾通道电流降低,在脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养基里面加了Apocynin（NADPH氧化酶的抑制剂）,加药后子痫前期的钾电流明显上升,K离子通道两种亚基KCNMB1,SK3以及内皮细胞eNOS无论是蛋白还是基因表达均明显升高,有显著性差异。以上实验结果得出结论:子痫前期脐静脉内皮细胞的NO功能受损,可能由于其病理状态使胎盘发生缺血缺氧,出现了氧化应激,导致氧自由基增多,钙离子水平增加,下调Ca²⁺依赖的K离子通道功能,由此减少了eNOs和NO分泌和产生,使得内皮细胞功能受损,血管张力改变,引起全身血管痉挛,发生一系列的临床表现和体征。第一部分子痫前期脐静脉内皮细胞NO功能研究目的研究发现子痫前期发病机制中内皮细胞受损是一个很重要的因素,但有关内皮细胞受损的病理机制并不明确。NO作为血管内皮细胞所分泌的最为重要的血管舒张因子,可认为是内皮细胞功能的体现,本研究将检测正常与子痫前期产妇的脐静脉内皮细胞NO系统的情况,探讨和验证子痫前期血管内皮功能的变化。方法分别选取子痫前期（PE）和正常孕妇（NP）为研究对象,收集足量脐带样本和血清,并对脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行体外分离培养。采用RT-PCR和Western Blot法检测HUVEC的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达情况;硝酸还原法检测细胞培养基中一氧化氮（NO）含量。结果与正常孕妇组相比,PE组HUVEC的NO含量明显降低（P<0.05）;PE组HUVEC中eNOS的mRNA和蛋白水平均明显下降（P<0.05）。结论与正常孕妇组相比,子痫前期孕妇脐静脉内皮细胞NO功能受损明显。第二部分子痫前期钾离子通道电流变化影响内皮细胞NO功能目的子痫前期产妇HUVEC中NO受损是主要发病机制,本研究通过检测PE的HUVEC的K⁺通道电流,来探讨PE患者内皮细胞NO功能受损与离子通道异常的关联。方法用膜片钳方法分别检测子痫前期患者（PE）组和正常孕妇（NP）的HUVEC中K⁺通道电流道电流;采用RT-PCR和Western Blot法检测两组研究对象HUVEC的BKCa和SKCa通道亚基m RNA基因和蛋白表达;两组研究对象细胞培养基中加入IBTX（特异性BKCa通道抑制剂）、Apamin（SKCa通道抑制剂）,培养三天后再检测K⁺通道电流。结果与NP组相比,PE组HUVEC的K⁺通道电流明显降低（NP vs.PE:12.28±1.25p A/p F vs.5.45±0.51 p A/p F,TP=+60 m V,P<0.05）。PE组HUVEC的BKCa和SKCa通道m RNA基因和蛋白表达均低于NP组（P<0.05）。细胞培养基中加入K⁺通道的抑制剂IBTX或/（和）Apamin后,NP组的电流下降较PE组更明显（P<0.05）。结论子痫前期钾离子通道功能受损可能是影响其内皮细胞功能的主要因素。第三部分氧化应激与内皮细胞的钾通道电流和NO的相关性研究目的已有研究认为过度的氧化应激为子痫前期疾病发生发展的重要机制。本研究通过检测子痫前期患者的HUVEC的氧化应激合成物—超氧化物的含量和蛋白基因表达,探讨PE患者氧化应激与细胞钾通道功能的关联,并进一步探讨氧化应激与内皮功能、细胞钾通道三者之间的相关性。方法选取子痫前期患者和正常产妇的HUVEC,通过DHE荧光法定性分析HUVEC超氧化物的变化,用ELISA法检测HUVEC的超氧化物含量;分别用Q-PCR和Western方法检测HUVEC的氮氧化合物催化的亚基-NOX1、NOX2、NOX4基因和蛋白表达情况。在HUVEC的培养基里面加入Apocynin（NADPH氧化酶抑制剂）,检测加药前后两组HUVEC的KCNMB1,SK3及e NOS的m RNA基因和蛋白表达并比较;收集加药培养后的HUVEC培养液,检测其NO含量。结果PE组HUVEC的荧光强度和超氧化物的含量显著高于NP组,说明PE组HUVEC的ROS高于NP组;PE组HUVEC的NOX2的基因和蛋白表达及培养液的NOX2的含量高于NP组;PE组加入Apocynin后的HUVEC钾电流明显上升;与NP组比较,差异性显著。加药后PE组的HUVEC的KCNMB1,SK3及e NOS的m RNA基因和蛋白表达均上调,NO含量明显上升。结论子痫前期通过NOX介导的活性氧系列（ROS）抑制的内皮细胞钾通道（BKCa和SKCa）,进而导致细胞内皮NO功能改变。更多还原

【Abstract】 Part I The research of umbilical vein endothelial cell function in patients of preeclampsiaObjective:Damage of endothelial cells in the pathogenesis of preeclampsia is an apparent factor.Through detecting endothelial function of umbilical vein endothelial cells(HUVEC),our experiment verified that the damage of endothelial function in patients of preeclampsia is an important mechanism.Methods:Patients of preeclampsia(PE)and normal pregnant ones(NP)are chosen as two teams respectively.Collecting HUVEC and serum of both groups,methods of PCR and Western blot were used to detect gene and protein expression of eNOS in both groups,and nitrate reduction method was used to detect the NO content of endothelial cell medium.Results:Compared with NP,the NO content of HUVEC of PE group was obviously lower(P < 0.05).Gene and protein expression of HUVEC eNOS in the PE group was decreased obviously(P < 0.05).Conclusion:Through NO content and expression of eNOS of HUVEC in the two groups,endothelial function of PE is significantly weaker than NP.Part II The change of potassium channel current impact on umbilical vein endothelial cell function in patients of preeclampsiaObjective: Based on damage of endothelial cells in the pathogenesis of preeclampsia,we assumed that potassium channels currents are connected with umbilical vein endothelial cells of preeclampsia.All above verified that the change of preeclampsia is caused by K+ channel and endothelial cell damage.Methods: We measured potassium channel current of the two groups(PE and NP ones)respectively with patch clamp technique.After adding IBTX(BKa channel inhibitor)and apamin(SKa channel inhibitor)to endothelial cell medium,potassium channel current of the two groups was measured again with the same technique.Results: Compared with NP,potassium channel current of HUVEC of PE group was obviously lower,(NP vs.PE: 12.28±1.25 p A/p F vs.5.45±0.51 p A/p F;TP=+60 m V,P<0.05).After adding IBTX and apamin to endothelial cell medium.Potassium channel current of HUVEC of NP team decreased obviously(from 12.08±1.16 p A/p F at baseline to 7.24±0.80 p A/p F,TP=+60 m V,P<0.05,Figure 2C),while that change of HUVEC of PE team is little.Conclusion: Through two groups data of potassium channel current of HUVEC,The function of ion channel of NP is normal,but that of PE is be destroyed.It showed that damage of potassium channel current impact on umbilical vein endothelial cell function in patients of preeclampsia.Part III Oxidative stress related to potassium channel current of endothelial cell and NO synthesis in preeclampsiaObjective: Oxidative stress of preeclampsia has been unbalance.Our experiment tested the content of superoxide and protein expression t of the umbilical vein cells,which verified that the oxidative stress of preeclampsia damaged potassium channels currents of endothelial cells and endothelial function.Methods: We compared two groups of HUVEC fluorescence color with DHE technique respectively.The content of the two groups of HUVEC superoxide was detected by ELISA;NOX1,NOX2,NOX4 protein and gene expression of the two groups of HUVEC is inspected with Q-PCR and Western technique.After adding Apocynin(inhibitors of NADPH oxidase)to HUVEC culture of two groups,all above are inspected again.KCNMB1,SK3,as well as the expression of e NOS were compared.After collection of the dosing of HUVEC culture,the NO content was detected.Results: Compared with NP,the HUVEC fluorescence color OF PE group was obvious.The content of superoxide and protein expression of HUVEC of PE group were higher than those of NP ones.Potassium channels currents is higher after adding Apocynin to HUVEC culture of PE.Besides,KCNMB1,SK3 and e NOS protein and gene expression of PE raised markedly.Conclusion: NOX-mediated ROS(reactive oxygen species)inhibited BKCa 和 SKCa and damaged endothelial NO system.更多还原