【作者】 林伟；

【导师】 张景强；

【作者基本信息】 中山大学 ， 动物学， 2001， 博士

【摘要】 质多角体病毒属呼肠孤病毒科质多角体病毒属,其宿主包括200 多种昆虫。家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)是质多角体病毒的代表种。该病毒仅有单层衣壳,病毒离子呈二十面体对称,二十面体的十二个顶点均有双层突起。完整的BmCPV 基因组为10 片段双链RNA,结构蛋白含有5 种组分并具有转录酶、甲基转移酶等多种酶活性。已有的BmCPV 分子生物学及冷冻电镜三维重构的研究结果表明,dsRNA 片段5 编码蛋白p101 的属性(属于结构蛋白或非结构蛋白)尚未确定;dsRNA 片段4 编码病毒主要衣壳蛋白VP3。VP3 在病毒结构蛋白中含量丰富,可能是病毒粒子衣壳外表面120 个突起的组成成分。为了鉴定p101 蛋白的属性以及验证衣壳蛋白VP3 是否位于病毒粒子的外表面,本文以BmCPV 中国株为材料,运用RT-PCR 及分子克隆技术完成了BmCPV dsRNA片段4 和5 的全序列测定。 dsRNA片段4 长3262 bp,含有一个完整的开放读码框(14nt~3190nt),编码一个长1058氨基酸的多肽(127 kDa);dsRNA 片段5 长2852 bp,含有一个完整的开放读码框(71nt~2716nt),编码一个长881 氨基酸的多肽(101 kDa)。测序结果已登录GenBank,序列接受号分别为AF433659 和AF433660。在此基础上,利用质粒载体pET-21a在原核系统中分别成功地表达了dsRNA片段4 和5 编码的蛋白VP3 和p101,表达量分别达15%和10%左右。免疫印迹实验表明,原核系统表达的dsRNA片段4编码蛋白即为病毒结构蛋白VP3,dsRNA片段5 编码蛋白p101 的鸡抗多克隆抗体与病毒结构蛋白VP4 有特异结合反应,该结果说明蛋白p101 序列中类似口蹄疫病毒2Apro的17 氨基酸(219~235)基序在宿主体内病毒成熟过程中可能起翻译后的自动切割作用,结构蛋白VP4 即是dsRNA片段5 编码蛋白p101 的酶切产物。应用重组蛋白VP3 的抗体进行免疫电镜定位研究,照片显示部分病毒粒子更多还原

【Abstract】 Cytoplasmic polyhedrosis virus (CPV) which can infect more than twohundred insects belongs to the Cypovirus genus in the Reoviridae family.Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus is a model of CPV. It appears asa single-shelled icosahedron with 12 characteristic two-layer spikes. The fullBmCPV particle contains a 10-segmented double-stranded RNA (dsRNA)genome and is composed of five structural proteins as well as severalenzymes including transcriptase and transmethylase.The obtained BmCPV research results of molecular biology and the three-dimensional structure of cryo-electron microscope (cryoEM) reveled that thecharacteristic (belongs to structural protein or nonstructural protein) of proteinp101 encoded by dsRNA segment 5 has not been clarified, and that dsRNAsegment 4 encoded the viral capside protein VP3. The VP3 is one of the mostabundant protein in the structural ones of virus, which may be the candidatefor the 120 large protrusions (LPs) on the outside of the viral capsid shell. Inorder to clarify the characteristic of p101 and confirm if the capsid protein VP3is located on the outside of the virus particle or not, we use the BmCPVChinese strain as the material and sequence the full length of the BmCPVdsRNA segment 4 and 5 by RT-PCR and molecular cloning techniques.Segment 4 consisted of 3263 nucleotides and possessed a long open readingframe (14nt-3190nt) encoding a protein (MW:127kDa) of 1058 amino acids.Segment 5 consisted of 2852 nucleotides and possessed a long open readingframe (71nt-2716nt) encoding a protein (MW:101kDa) of 881 aminoacids.The sequences of dsRNA segment 4 and segment 5 have been更多还原