清解宁对白细胞与血管内皮细胞粘附机制的研究

【作者】 任钧国；

【导师】 邱全瑛；

【作者基本信息】 北京中医药大学 ， 中西医结合基础， 2003， 博士

【摘要】 白细胞与血管内皮细胞的粘附是白细胞移行、淋巴细胞再循环的关键一步，在炎症反应和免疫应答中具有重要的意义。黄连解毒汤及其主要成分小檗碱、黄芩苷、栀子苷等具有一定的抗炎、免疫等调节作用，因此，黄连解毒汤的作用可能与其主要成分小檗碱、黄芩苷、栀子苷等的综合作用有关。本实验根据黄连解毒汤及主要成分的研究结果，将黄连解毒汤的几种主要成分组合成复方清解宁。在整体、细胞、分子、基因以及细胞内信号转导的水平上研究清解宁对白细胞与内皮细胞粘附及粘附分子表达的影响，从细胞粘附分子的新领域研究清解宁抗炎免疫作用的机制。1 整体实验1．1清解宁对绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠免疫功能的作用用SRBC免疫小鼠形成迟发型超敏反应动物模型，分别用小鼠脚掌厚度测量法观察迟发型超敏反应（DTH），溶血分光光度法测抗体形成细胞数（PFC）、MTT法检查脾T、B淋巴细胞的增殖功能，中性红比色法观察腹腔Mφ吞噬中性红的能力。选择高（14mg/kg），中(7mg/kg)，低(3.5mg/kg)三个剂量观察清解宁的免疫调节作用。结果显示：（1）清解宁三个剂量均能明显降低SRBC免疫小鼠的DTH指数（P<0.05），具有一定的量效关系。（2）清解宁高中两个剂量能明显抑制小鼠抗体形成细胞数（P<0.05,P<0.01），低剂量作用不显著（P>0.05）。（3）清解宁三个剂量均能抑制ConA诱导的T淋巴细胞的增殖（P<0.01）；（4）清解宁三个剂量皆能抑制LPS诱导的B淋巴细胞的增殖（P<0.01）。（5）清解宁三个剂量皆能降低小鼠腹腔Mφ吞噬中性红的能力（P<0.01）。结果提示：清解宁对细胞免疫、体液免疫、Mφ吞噬功能具有明显的免疫抑制作用。1．2 清解宁对SRBC免疫小鼠细胞因子的作用以巨噬细胞NO2ˉ-释放法检测IFN-γ水平，胸腺细胞法检测IL-1水平，丝裂原激活的淋巴母细胞法检测IL-2水平，观察清解宁对SRBC免疫小鼠IL-1、IFN-γ、IL-2的影响。结果显示：（1）清解宁三个剂量皆能显著降低SRBC免疫小鼠血清中的IL-1水平（P<0.05，P<0.01），也能显著抑制LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1（P<0.05，P<0.01）。（2）清解宁能显著降低小鼠血清中的IL-2水平（P<0.05，P<0.01），也能显著抑制ConA诱导小鼠脾细胞分泌IL-2（P<0.05，P<0.01）。（3）清解宁三个剂量皆能显著降低血清中的IFN-γ水平（P<0.01），也能显著抑制ConA诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ（P<0.01）。结果提示：清解宁能抑制免疫细胞分泌IL-1、IL-2、IFN-γ，可能与其抗炎免疫抑制作用有关。2 离体实验2．1清解宁对白细胞与血管内皮细胞粘附的影响用MTT法检测清解宁对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人外周血单个核细胞（PBMC）活力的作用，用台盼蓝计数法检测清解宁对人外周血中性粒细胞（PMN）活力的作用，结果显示：清解宁对三种细胞活力无影响的最大浓度为117μg/ml。故选择高（117μg/ml）、中（58.5μg/ml）、低（29.25μg/ml）三个浓度，用虎红染色法观察清解宁对PMN、PBMC与TNF诱导的HUVEC粘附的作用。结果显示：（1）清解宁作用HUVEC 2h及12h后，高、中两个浓度皆能<WP=6>明显降低PMN-HUVEC的粘附（P<0.05，P<0.01）。低浓度的清解宁作用2h，能明显抑制PMN-HUVEC的粘附（P<0.01），而12h无作用（P>0.05）。（2）清解宁作用HUVEC 2h与12h后，高浓度能明显降低PBMC-HUVEC的粘附（P<0.05，P<0.01），中浓度作用HUVEC 2h后，能明显降低PBMC-HUVEC的粘附（P<0.05），而作用12h后则无作用（P>0.05）；低浓度作用HUVEC 2h与12h后，皆没有明显的作用（P>0.05）。结果提示：清解宁具有抗白细胞粘附的作用；其作用与药物的浓度和白细胞的类别有关。2．2 清解宁对血管内皮细胞与白细胞粘附分子表达的影响选择高（117μg/ml）、低（58.25μg/ml）两个浓度，用细胞ELISA和免疫荧光法检测清解宁对TNF诱导的HUVEC表面粘附分子E-selectin、ICAM-1、CD44和PBMC、PMN表面细胞粘附分子CD18表达的影响。结果显示：（1）清解宁作用HUVEC2h,高低两种浓度皆能显著抑制TNF诱导的E-selectin的表达（P<0.05）；作用12h，作用不明显（P>0.05）。（2）清解宁作用2h、12h，高低两个浓度皆能抑制TNF诱导的ICAM-1的表达（P<0.01）。（3）清解宁作用2h、12h，高低两个浓度皆能抑制TNF诱导的CD44的表达（P<0.01）。（4）清解宁作用1h，能显著抑制TNF诱导的PMN表面CD18的表达（P<0.01）。（5）清解宁作用1h，能显著抑制TNF诱导的PBMC表面CD18的表达（P<0.01）。结果提示：清解宁抑制HUVEC表面粘附分子E-selectin、ICAM-1、CD44和PBMC、PMN表面细胞粘附分子CD18的表达可能与其抗白细胞粘附的作用有关。2．3清解宁对血管内皮细胞粘附分子E-selectin mRNA与ICAM-1 mRNA 表达的影响采用RT-PCR的方法，观察清解宁对TNF诱导的HUVEC E-selectin与ICAM-1 mRNA表达的影响。结果显示：（1）清解宁作用HUVEC2h，高低两个浓度均能抑制TNF诱导的E-selectin mRNA的表达（P<0.05，P<0.01）。（2）清解宁作用HUVEC12h，高低两种浓度均能明显抑制TNF诱导的ICAM-1 mRNA的表达（P<0.05，P<0.01）。结果提示：清解宁可能通过抑制TNF诱导的HUVEC E-selectin mRNA与ICAM-1 mRNA的表达抑制E更多还原

【Abstract】 The adhesion of leukocyte to vascular endothelial cell is the key step of leukocyte migration and lymphocyte recirculation, and plays a essential role in inflammation and immune response.HuangLianJieDuTang (HLJDT) and it’s major chemical component berberine、baicalin、gardenoside have the function of anti-inflammation and immune regulation and others.Therefore,the function of HLJDT is may be related to the synergy effects of it’s major chemical components berberine、baicalin、gardenoside.Based on the study results of the HLJDT and it’s major chemical components,the prescription of QingJingNing (QJN) was consist of the major components of HLJDT in this experiment.The influence of QJN on the adhesion of leukocyte to endothelial cell and adhesion molecules expression was investigated in vivo and in vitro,so as to research the machanism of anti-inflammation and immune regulation function of QJN .1 Experiments in vivo1.1 The effects of QJN on immune function in SRBC-immunized miceTo study the effects of QJN on immune function in mice with high dose（14mg/kg），middle dose (7mg/kg) and low dose (3.5mg/kg) . The animal model was made by immuning mice with sheep red blood cell (SRBC),delayed type hypereneitivity (DTH) by measuring foot thickness,quantity of plaque forming cell (PFC) by hemolytic spectrophotometry, proliferation of T and B lymphocyte by MTT colorimetry, phagocytosis of Mφ in abdominal cavity by neural red colorimetry were observed respectively. The results demonstrated:(1)Three dose could significantly decrease DTH index in mice (P<0.05).(2)High dose and middle dose both could siginificantly inhibit PFC（P<0.05,P<0.01）, low dose had no effect（P>0.05）. (3) Three dose could significantly inhibit proliferation of T lymphocyte induced by ConA (P<0.01).(4) Three dose could significantly inhibit proliferation of B lymphocyte induced by LPS (P<0.01).(5) Three dose could significantly decrease the phagocytosis of Mφin mice.The results indicates that QJN has siginificant effects of anti-inflammation and immunosuppression.1.2 The effects of QJN on cytokine in SRBC-immunized miceTo investigate the effects of QJN on IL-1、IFN-γ、IL-2 in SRBC-immunized mice. The IFN-γlevel was measured by macrophage NO2ˉ-release assay, the IL-1 level was measured by thymocyte assay, the IL-2 level was measured by mitogen activated lymphocytoblast assay respectively. The results showed:（1）Three dose could significantly decrease IL-1 in serum (P<0.05，P<0.01),and also could inhibit macrophage to secrete IL-1 induced by LPS (P<0.05，P<0.01).(2) Three dose could significantly decrease IL-2 in serum (P<0.05，P<0.01),and also could inhibit splenocyte to secrete IL-2 induced by ConA (P<0.05，P<0.01).(3) Three dose could significantly decrease IFN-γ in<WP=9>serum (P<0.05，P<0.01),and also could inhibit splenocyte to secrete IFN-γ induced by ConA (P<0.05，P<0.01).The results suggests that the inhibition effects of QJN on immunocyte to secret IL-1、IFN-γ and IL-2 could be associated with anti-inflammation and immunosuppression.2 Experiments in vitro2.1 The effects of QJN on the adhesion of leukocyte to HUVEC The highest concentration of QJN without effect on cell activity was 117μg/ml determined by the effect of QJN on activity of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)and human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) by MTT assay,and the effect of QJN on activity of human peripheral blood polymorphonuclear(PMN) cell by trypan-blue stain assay.Based on this result,the effects of QJN with high (117μg/ml)、middle (58.5μg/ml)、low(29.25μg/ml)concentration on the adhesion of PMN、PBMC to HUVEC TNF-induced were oberserved. The results showed:(1)After 2h and 12h HUVEC treated with high and middle concentration QJN,both could siginificantly decrease the PMN-HUVEC adhesion (P<0.05，P<0.01), after 2h HUVEC treated with low concentration QJN ,QJN could siginificantly decrease the adhesion of PMN to HUVEC (P<0.01),but had no effect after 12h (P>0.05).(2) After 2h and 12h HUVEC treated with high c更多还原