【作者】 彭世清；

【导师】 陈守才；

【作者基本信息】 华南热带农业大学 ， 作物遗传育种， 2001， 博士

【摘要】 天然橡胶分子是在橡胶粒子的表面合成的，一些与天然橡胶分子合成相关的酶就位于橡胶粒子上。除橡胶延长因子、橡胶转移酶、23KD的小粒子蛋白等少数几种橡胶粒子膜蛋白的功能基本清楚以外，其余橡胶粒子膜蛋白的研究尚未见报道。另外，橡胶粒子是怎样形成的，至今为止仍然是一个谜。要了解橡胶粒子的生物学功能和形成机制，有必要了解橡胶粒子膜蛋白的结构和功能。我们对大小橡胶粒子膜蛋白进行分离、纯化，并对其进行了SDS-PAGE图谱比较，发现橡胶树的大小橡胶粒子的某些膜蛋白的含量存在较显著的差异，43KD的橡胶粒子膜蛋白是其中的一个差异蛋白。为了探讨43KD的橡胶粒子膜蛋白的生物学功能，我们对其进行了cDNA的克隆和表达的研究。 本研究对43KD的橡胶粒子膜蛋白进行了分离纯化，并对N端氨基酸进行了序列分析，N端前20个氨基酸序列为MQIFVKTLGKTITILEVESS。根据43KD的橡胶粒子膜蛋白N端氨基酸序列，设计一简并引物，通过3’RACE的方法，获得了43KD的橡胶粒子膜蛋白的cDNA。该cDNA含有1385个核苷酸，含有完整的阅读框架，编码381个氨基酸。在终止密码子下游，包含有一个239bp的3’非编码区，其中包括一个多聚腺苷酸化信号AATAAA，以及一个含17个腺苷酸的ploy（A）。将cDNA序列进行BLAST分析，结果表明，该cDNA由5个首尾相连的的重复单元组成，每个单元编码76个氨基酸组成的Ubiquitin单体。在最后一个单元的末端含有额外的苯丙氨酸的密码子。在氨基酸组成上，与典型的Ubiquitin比较，第二单元的第十个氨基酸发生变异，由E→G，第三单元的51-52，54-58位的氨基酸由KQ→SS，EDGRT→RMVAP。用Ubiquitin的抗体对橡胶粒子膜蛋白进行Western blot分析，得到一条约43kD的杂交带，表明43KD的橡胶粒子膜蛋白可能是一种Polyubiquitin。基因组DNA Southern杂交分析表明，编码43kD橡胶粒子蛋白的多聚遍在蛋白基因是多拷贝基因，和从拟南芥、水稻等中获得的ubiquitin基因报导相一致。利用Genome Walker的方法获得橡胶树Polyubiquitin基因的5’非编码区，序列分析表明，在第一个ubiquitin的起始密码子前含有一个内含子，内 中国抓带农业科学＠华审热带驭业人学 200届淬士论文 三含厂为1门讣p。对前导序列的分析表明存在n：ArITA加x、＊＊AT。。。川、刁加X、1－ISE以及“＊CA巾e”等凋控元件。另外，还存公一个约刀0加的小丁含线丰富（”％）的p域。N口r山ernH。；分析表明，该基因在胶乳中的表达量比叫片和树皮中高。d：对人厂判利升判橡胶树中，乙烯和茉莉酸处理均导致该基因表达的增强。更多还原

【Abstract】 Cloning and Expression of cDNA Encoding 43KD Rubber Particle Membrane Protein of Hevea brasiliensisAbstractA 43KD rubber particle protein was purified from latex yielding a single protein with an apparent molecular mass of 43KD as determined by SDS-PAGE. A degenerate oligonucleotide primer based on the N-terminal amino acid sequence of this purified 43KD rubber particle protein was used to amplify a 1385 bp cDNA by 3’apid amplification of cDNA ends (3’ACE) The structure of the cDNA is consistent with structure of other known polyubiquitin genes. It contains of five repeats in a head-to-hail arrangement without intervening sequences, each encoding an ubiqutin unit of 76 amino acids. At the carboxyl-terminal end of the last ubiqutin unit followed an extra phenylanaline residue. Southern blot analyses revealed that are multiple copies of gene encoding 43KD rubber particle protein in H. Brasiliensis. Western blot demonstrated 43KD rubber particle protein maybe a polyubiquitin. Northern blot analysis of RNA isolated from the latex, young leaves and bark revealed that expression was highest in the latex and lowest in young leaves. The polyubiquitin gene was induced by exogenous ethylene and jasmonic acid treatments. The 5?-UTR was obtained using GenomeWalker. It contained an 1175bp intron immediately 5?to the initiation code for the first ubiquitin-coding. Several sequences similar to eukaryotic cis regulatory element were found in the 5?UTR 430bp proximal 5?flanking sequence. A putative TATA box sequences found at -33bp. At position -79bp, a TCAAT sequence can be observed, which is similar to the CAAT?motif found in a multitude of higher eukaryotic promoters. The G-box element sequence, CACGTG, was found at -127bp. Some sequences 5-nGAAn-3 present many positions, which is similar to the consensus heat-shock element. The A+T rich region, containing 900/a A+T in the 230bp sequence, is present in the 5 flanking region.更多还原